Cytometria przepływowa to cytologiczna metoda badawcza stosowana do dogłębnej analizy komórek. Jego zaletą jest to, że pozwala na indywidualne badanie każdej komórki. Ten rodzaj analizy pomaga ocenić kilka parametrów w setkach komórek w ciągu kilku sekund. W rezultacie cytofluorymetria jest uważana za jedną z najszybszych i najdokładniejszych metod analizy dostępnych obecnie dla naukowców i klinicystów.
Zasada
Zasada cytometrii przepływowej opiera się na pomiarze rozpraszania światła i luminescencji (fluorescencji) komórek. Zawiesina komórkowa jest przepuszczana w postaci strumienia z dużą prędkością przez komórkę cytometru, gdzie jest naświetlana laserem. Wykonywane jest tam również tzw. ogniskowanie hydrodynamiczne. Jego mechanizm polega na tym, że przepływ z komórki z badanymi cząstkami na wylocie wpływa do zewnętrznego strumienia, który ma większą prędkość. W rezultacie cząsteczki są ułożone w uporządkowany łańcuch.
Komórki wstępne są oznakowane specjalnymi barwnikami fluorescencyjnymi (fluorochromami). Dzięki nim wiązka laserowawzbudza wtórny blask. Odebrane sygnały świetlne są rejestrowane przez detektory. Następnie informacje są przetwarzane przy użyciu algorytmów oprogramowania, które pozwalają zliczać poszczególne populacje komórek różniące się niektórymi kryteriami.
Badania z użyciem konwencjonalnej mikroskopii często nie pozwalają na rozróżnienie między różnymi komórkami, ponieważ wyglądają tak samo. Cytofluorymetria może dostarczyć innych danych (integralność struktury DNA), przeanalizować ekspresję białek, przeżycie komórek.
Ponieważ wzbudzenie fluorochromów wymaga wiązek światła o różnych długościach fal, a także różnych typów detektorów, nowoczesne instalacje wyposażone są w kilka kanałów detekcji (od 4 do 30). Liczba emiterów laserowych może wynosić od 1 do 7. Bardziej złożone urządzenia umożliwiają wieloparametrowe badania kilku właściwości cząstek jednocześnie.
Zalety i wady
Korzyści z cytometrii przepływowej obejmują:
- duża prędkość przetwarzania (rejestracja do 30 tysięcy zdarzeń w ciągu 1 sekundy);
- możliwość badania dużej liczby komórek (do 100 milionów w próbce);
- Ocena ilościowa natężenia światła fluorescencyjnego;
- analiza każdej komórki;
- jednoczesne badanie procesów heterogenicznych;
- automatyczne rozdzielanie danych według populacji komórek;
- jakość wizualizacji wyników.
Kolejną cechą tej technologii jest to, żeanalizowaną cząstkę można wybarwić kilkoma roztworami fluorescencyjnymi. Dzięki temu następuje wieloparametrowe badanie.
Wady obejmują złożoność wyposażenia technicznego i konieczność specjalnego przygotowania próbek.
Cytometry
Pierwsze urządzenia tego typu pojawiły się już w 1968 roku w Niemczech, ale rozpowszechniły się znacznie później. Obecnie wszystkie urządzenia pracujące metodą cytometrii przepływowej można podzielić na 2 typy:
- urządzenia mierzące promieniowanie fluorescencyjne (dwie lub więcej długości fal), rozpraszanie światła pod kątem 10° i 90° (detektor rozproszenia niskiego kąta i bocznego);
- urządzenia, które oprócz pomiaru kilku parametrów sieci komórkowej, automatycznie sortują grupy według tych kryteriów.
Detektor rozpraszania do przodu jest przeznaczony do określania rozmiaru komórki, a urządzenie do rozpraszania bocznego umożliwia uzyskanie informacji o obecności granulek wewnątrzkomórkowych, stosunku objętości cytoplazmy do jądra.
Klasyczne cytometry, w przeciwieństwie do mikroskopów świetlnych, nie pozwalają na uzyskanie obrazu komórki. Jednak w ostatnich latach opracowano połączone urządzenia, które są w stanie połączyć możliwości mikroskopu i cytofluorymetru. Zostaną one omówione poniżej.
Cytometry obrazujące
Dla przyrządów używanych w klasycznej cytometrii przepływowej,jedna cecha jest charakterystyczna: jeśli w populacji analizowanych komórek rejestrowane są rzadkie zdarzenia, to nie ma możliwości oceny ich istoty. Cząsteczki te mogą być pozostałościami martwych komórek lub rzadką ich grupą. W urządzeniach konwencjonalnych takie dane są wyłączone z ogólnego toku zdarzeń, ale to one mogą mieć szczególną wartość dla analizy naukowej i klinicznej.
Nowa generacja obrazujących cytometrów przepływowych umożliwia przechwytywanie obrazu każdej komórki przechodzącej przez strefę detektora. Łatwo to zobaczyć, klikając odpowiedni obszar diagramu, który jest wyświetlany na monitorze komputera.
Obszary zastosowań
Cytometria przepływowa to uniwersalna metoda stosowana w wielu dziedzinach medycyny i nauki:
- immunologia;
- onkologia;
- transplantologia (przeszczepienie czerwonego szpiku kostnego, komórek macierzystych);
- hematologia;
- toksykologia;
- biochemia (pomiar kwasowości wewnątrz komórki, badanie innych parametrów);
- farmakologia (tworzenie nowych leków);
- mikrobiologia;
- parazytologia i wirusologia;
- oceanologia (badanie fitoplanktonu w celu oceny stanu zbiorników wodnych i innych zadań);
- nanotechnologia i analiza mikrocząstek.
Immunologia
Ludzki układ odpornościowy składa się z wielu różnych komórek. Cytometria przepływowa w immunologii umożliwia ocenę ich budowy i funkcji, czyli przeprowadzenie czynności morfofunkcjonalnychanaliza.
Takie badania pomagają zrozumieć złożoną naturę odporności. Fenotypy komórek zmieniają się w wyniku aktywacji przez antygeny, rozwoju patologii i innych czynników. Cytofluorometria może oddzielać subpopulacje komórek odpornościowych w złożonej mieszaninie i oceniać wszystkie ich zmiany w czasie.
Onkologia
Jednym z najważniejszych zadań w onkologii jest różnicowanie komórek w zależności od ich typu. Zasada analizy metodą cytometrii przepływowej w onkohematologii opiera się na następującym zjawisku: próbka poddana działaniu specjalnego barwnika fluorescencyjnego wiąże się z białkami cytoplazmatycznymi. Po podziale w aktywnie proliferujących komórkach jego zawartość zmniejsza się o połowę. W związku z tym intensywność luminescencji komórek zmniejsza się dwukrotnie.
Istnieją inne sposoby wykrywania proliferujących komórek:
- użycie barwników wiążących DNA (jodek propidyny);
- użycie oznaczonego uracyl;
- rejestracja zwiększonego poziomu ekspresji białek cyklin, które biorą udział w regulacji cyklu komórkowego.
