Chromatografia to jedna z metod oddzielania substancji. Służy do późniejszej jakościowej i ilościowej analizy właściwości fizycznych i chemicznych mikrocząstek. Odmianą tej technologii jest chromatografia powinowactwa. Idea różnicowania związków białkowych z wykorzystaniem właściwości powinowactwa molekularnego znana jest w nauce od kilkudziesięciu lat. Otrzymał jednak swój rozwój dopiero w ostatnich latach, po wprowadzeniu wysoce porowatych materiałów hydrofilowych stosowanych jako osnowa. Metoda ta pozwala na rozwiązywanie zarówno problemów analitycznych (oddzielanie substancji i ich identyfikacja), jak i przygotowawczych (oczyszczanie, zagęszczanie).
Esencja
Chromatografia powinowactwa (od łacińskiego słowa affinis – „sąsiadujący”, „pokrewny”) opiera się na interakcjach powinowactwa, które polegają na tworzeniu wysoce specyficznych wiązań między cząsteczką rozdzielającą (ligandem lub powinowatą) a cząsteczką docelową. Mechanizmy te są szeroko rozpowszechnione (połączenie mediatorów lub hormonów i receptorów, przeciwciał iantygeny, hybrydyzacja polinukleotydów i inne rodzaje procesów). W medycynie chromatografia powinowactwa jest wykorzystywana do celów praktycznych od 1951 roku
Komponenty są oddzielone w następujący sposób:
- roztwór roboczy zawierający izolowaną substancję przechodzi przez sorbent;
- ligand osadzony na matrycy sorbentu zatrzymuje tę substancję;
- jest skoncentrowany (akumulacja);
- ekstrakcja wyizolowanej substancji z sorbentu poprzez przemycie rozpuszczalnikiem.
Ta metoda umożliwia izolowanie całych komórek. Różnica w stosunku do tradycyjnej chromatografii sorpcyjnej polega na silnym biospecyficznym wiązaniu wyizolowanego składnika z sorbentem, który charakteryzuje się wysoką selektywnością.
Adsorbenty
Jako adsorbenty stosowane są następujące substancje:
- Związki żelowe na bazie agarozy, polisacharydu otrzymywanego z agaru. Najczęściej stosowane są 3 odmiany: sepharose 4B, CL (agaroza usieciowana) oraz affi-gel. Ta ostatnia kompozycja to zmodyfikowany żel agarozy i poliakrylamidu. Posiada większą obojętność biologiczną, wysoką odporność chemiczną i termiczną.
- Krzemionka (żel krzemionkowy).
- Szkło.
- Polimery organiczne.
Aby wyeliminować mechaniczne przeszkody w kontakcie z ligandem, stosuje się dodatkowe substancje oddzielające go od nośnika (peptydy, diaminy, poliaminy, oligosacharydy).
Sprzęt
Sprzęt do chromatografii powinowactwa obejmuje następujące jednostki główne:
- zbiorniki magazynowe dla fazy ruchomej (eluent);
- pompy wysokociśnieniowe do zasilania medium (najczęściej tłokowe);
- filtr do czyszczenia eluentów z kurzu;
- urządzenie dozujące;
- kolumna chromatograficzna do rozdzielania mieszanin;
- detektor do wykrywania rozdzielonych składników opuszczających kolumnę;
- rejestratory chromatogramów i jednostka mikroprocesorowa (komputer).
Aby zmniejszyć ilość rozpuszczonego powietrza, hel najpierw przechodzi przez fazę ruchomą. Do zmiany stężenia eluentu instalowanych jest kilka pomp sterowanych przez programator. Kolumny chromatograficzne wykonane są ze stali nierdzewnej (dla podwyższonych wymagań na odporność na korozję), szkła (opcja uniwersalna) lub akrylu. Do celów preparatywnych ich średnica może wahać się od 2 do 70 cm. W chromatografii analitycznej stosuje się mikrokolumny Ø10-150 µm.
Aby zwiększyć czułość detektorów, do mieszaniny wprowadzane są odczynniki, które przyczyniają się do tworzenia substancji pochłaniających więcej promieni w ultrafiolecie lub widzialnym obszarze widma.
Metodologia
Istnieją 2 główne typy chromatografii powinowactwa cieczy:
- Kolumna, w której kolumna jest wypełniona fazą stacjonarną i przepuszczana jest przez nią mieszanina z przepływemeluent. Separacja może nastąpić pod ciśnieniem lub pod wpływem grawitacji.
- Cienka warstwa. Eluent porusza się wzdłuż płaskiej warstwy adsorbentu pod wpływem sił kapilarnych. Adsorbent nakłada się na płytkę szklaną, pręt ceramiczny lub kwarcowy, folię metalową.
Główne etapy pracy obejmują:
- przygotowanie adsorbentu, utrwalenie ligandu na nośniku;
- podawanie mieszaniny rozdzielającej do kolumny chromatograficznej;
- ładowanie fazy ruchomej, wiązanie komponentów przez ligand;
- zmiana fazy w celu wyizolowania związanej substancji.
Miejsce docelowe
Chromatografia powinowactwa służy do izolowania następujących rodzajów substancji (rodzaj użytego ligandu jest wskazany w nawiasach):
- analogi inhibitorów enzymatycznych, substratów i kofaktorów (enzymów);
- substancje bioorganiczne z oznakami genetycznej obcości, wirusy i komórki (przeciwciała);
- węglowodany o dużej masie cząsteczkowej, polimery monosacharydów, glikoproteiny (lektyny);
- białka jądrowe, nukleotydylotransferazy (kwasy nukleinowe);
- receptory, białka transportowe (witaminy, hormony);
- białka oddziałujące z błonami komórkowymi (komórkami).
Ta technologia jest również wykorzystywana do pozyskiwania unieruchomionych enzymów, a wiązanie ich z celulozą umożliwia produkcję immunosorbentów.
Chromatografia białek wiążących DNA
Izolacja białek wiążących DNA jest wykonywana za pomocąheparyna. Ten glikozaminoglikan jest zdolny do wiązania szerokiej gamy cząsteczek. Chromatografia powinowactwa białek z tej grupy służy do izolowania substancji takich jak:
- czynniki inicjacji i elongacji translacji (synteza cząsteczek kwasu nukleinowego i białek);
- restrictazy (enzymy rozpoznające określone sekwencje w dwuniciowym DNA);
- Ligazy i polimerazy DNA (enzymy, które katalizują łączenie dwóch cząsteczek w celu utworzenia nowego wiązania chemicznego i biorą udział w replikacji DNA);
- inhibitory proteazy serynowej, które odgrywają ważną rolę w procesach odpornościowych i zapalnych;
- czynniki wzrostu: fibroblasty, schwann, śródbłonek;
- białka macierzy zewnątrzkomórkowej;
- receptory hormonalne;
- lipoproteiny.
Godność
Ta metoda jest jedną z najbardziej specyficznych dla izolacji reaktywnych związków (enzymów i większych agregatów - wirusów). Służy jednak nie tylko do izolowania substancji biologicznie czynnych.
Wykrywanie przeciwciał w małych ilościach, ilościowa ocena kwasu poliadenylowego, szybkie oznaczanie mas cząsteczkowych dehydrogenaz, usuwanie niektórych zanieczyszczeń, badanie kinetyki aktywacji nieaktywnej formy trypsyny, struktury molekularnej człowieka interferony - to nie jest cała lista badań, w których stosuje się powinowactwo chromatografia. Zastosowanie w klinice wynika z jej zalet, takich jak:
- Skuteczna zdolność czyszczeniabiałka, polisacharydy, kwasy nukleinowe. Różnią się nieznacznie właściwościami fizycznymi i chemicznymi oraz tracą aktywność podczas hydrolizy, denaturacji i innych rodzajów obróbki stosowanych w innych metodach.
- Szybkość separacji substancji, dynamiczna natura procesu.
- Nie ma potrzeby specjalnego oczyszczania enzymów i homogenizacji izoenzymów w celu określenia stałych dysocjacji.
- Możliwość oddzielenia szerokiej gamy substancji.
- Niskie zużycie ligandów.
- Możliwość separacji substancji w dużych ilościach.
- Odwracalny proces wiązania makrocząsteczek biologicznych.
Ta technika może być łączona z innymi, aby nałożyć dodatkowe pole (grawitacyjne, elektromagnetyczne). Pozwala to na rozszerzenie możliwości technicznych chromatografii.
Inżynieria enzymatyczna
Dzięki tej metodzie rozpoczął się aktywny rozwój nowej gałęzi biotechnologii - inżynierii enzymatycznej.
Chromatografia powinowactwa do izolacji enzymów ma następujące zalety:
- uzyskiwanie enzymów w dużych ilościach w wyniku skrócenia czasu, w efekcie - ich obniżenie ceny;
- immobilizacja enzymów może znacznie rozszerzyć zakres ich zastosowania w medycynie i przemyśle;
- Skojarzenie enzymów z nierozpuszczalnym podłożem stałym umożliwia badanie wpływu mikrośrodowiska i kierunku reakcji, które odgrywają ważną rolę w procesach naturalnych i fizjologicznych.
