Diagnostyka laboratoryjna prawie wszystkich chorób zakaźnych opiera się na wykrywaniu we krwi pacjenta przeciwciał, które są wytwarzane przeciwko antygenom patogenu metodami reakcji serologicznych. Weszli do praktyki medycznej od końca XIX do początku XX wieku.
Rozwój nauki pomógł określić strukturę antygenową drobnoustrojów i wzory chemiczne ich toksyn. Umożliwiło to stworzenie nie tylko surowic terapeutycznych, ale także diagnostycznych. Uzyskuje się je poprzez podawanie atenuowanych patogenów zwierzętom laboratoryjnym. Po kilku dniach ekspozycji krew królików lub myszy jest wykorzystywana do przygotowania preparatów służących do identyfikacji drobnoustrojów lub ich toksyn za pomocą testów serologicznych.
Zewnętrzna manifestacja takiej reakcji zależy od warunków jej wiązania i stanu antygenów we krwi pacjenta. Jeśli cząsteczki drobnoustrojów są nierozpuszczalne, wytrącają się, ulegają lizie, wiążą lub unieruchamiają w surowicy. Jeżeli antygeny są rozpuszczalne, pojawia się zjawisko neutralizacji lub precypitacji.
Reakcja aglutynacji (RA)
Serologiczny test aglutynacji jest bardzo specyficzny. Jest łatwy do wykonania i cichywizualne, aby szybko określić obecność antygenów w surowicy krwi pacjenta. Służy do badania reakcji Vidala (diagnoza duru brzusznego i paratyfusu) oraz Weigla (dur brzuszny).
Opiera się na specyficznej interakcji między ludzkimi przeciwciałami (lub aglutyninami) a komórkami drobnoustrojów (aglutenogenami). Po ich interakcji tworzą się cząstki, które wytrącają się. To pozytywny znak. Do wywołania reakcji można użyć żywych lub zabitych mikroorganizmów, grzybów, pierwotniaków, krwinek i komórek somatycznych.
Chemicznie reakcja jest podzielona na dwa etapy:
- Swoiste połączenie przeciwciał (AT) z antygenami (AG).
- Niespecyficzne - wytrącanie konglomeratów AG-AT, czyli tworzenie aglutynacji.
Reakcja pośrednia aglutynacji (IPHA)
Ta reakcja jest bardziej wrażliwa niż poprzednia. Służy do diagnozowania chorób wywołanych przez bakterie, pasożyty wewnątrzkomórkowe i pierwotniaki. Jest tak specyficzny, że można wykryć nawet bardzo niskie stężenia przeciwciał.
Do jego produkcji wykorzystywane są oczyszczone erytrocyty owiec i ludzkie czerwone krwinki, poddane wstępnej obróbce przeciwciałami lub antygenami (w zależności od tego, co technik laboratoryjny chce znaleźć). W niektórych przypadkach ludzkie krwinki czerwone są leczone immunoglobulinami. Uważa się, że reakcje serologiczne erytrocytów miały miejsce, jeśli osiadły na dnie probówki. O pozytywnej reakcjipowiedzmy, kiedy komórki są ułożone w formie odwróconego parasola, zajmującego całe dno. Reakcja ujemna jest liczona, jeśli erytrocyty osiadły w kolumnie lub w postaci guzika na środku dna.
Reakcja opadów (RP)
Reakcje serologiczne tego typu służą do wykrywania bardzo małych cząsteczek antygenów. Mogą to być np. białka (lub ich części), związki białek z lipidami lub węglowodanami, części bakterii, ich toksyny.
Surowice do reakcji są uzyskiwane przez sztuczne zarażanie zwierząt, zwykle królików. Tą metodą możesz uzyskać absolutnie każde strącające serum. Zachodzenie serologicznych reakcji strącania jest podobne w mechanizmie działania do reakcji aglutynacji. Przeciwciała zawarte w surowicy łączą się z antygenami w roztworze koloidalnym, tworząc duże cząsteczki białka, które osadzają się na dnie probówki lub na podłożu (żelu). Ta metoda jest uważana za wysoce specyficzną i może wykryć nawet nieznaczne ilości substancji.
Służy do diagnozowania dżumy, tularemii, wąglika, zapalenia opon mózgowych i innych chorób. Ponadto zajmuje się sądowym badaniem lekarskim.
Reakcja strącania żelu
Reakcje serologiczne można przeprowadzać nie tylko w płynnej pożywce, ale także w żelu agarowym. Nazywa się to metodą opadu rozproszonego. Z jego pomocą badany jest skład złożonych mieszanin antygenowych. Metoda ta opiera się na chemotaksji antygenów do przeciwciał i odwrotnie. Poruszają się w żeluwzględem siebie z różnymi prędkościami i spotykając się, tworzą linie opadów. Każda linia to jeden zestaw AG-AT.
Reakcja neutralizacji egzotoksyny z antytoksyną (PH)
Serum antytoksyczne są w stanie zneutralizować działanie egzotoksyny wytwarzanej przez mikroorganizmy. Te reakcje serologiczne są na tym oparte. Mikrobiologia wykorzystuje tę metodę do miareczkowania surowic, toksyn i toksoidów oraz określania ich działania terapeutycznego. Siłę neutralizacji toksyn określają jednostki konwencjonalne - AE.
Ponadto dzięki tej reakcji możliwe jest określenie gatunku lub typu egzotoksyny. Jest to wykorzystywane w diagnostyce tężca, błonicy, zatrucia jadem kiełbasianym. Badanie można przeprowadzić zarówno „na szkle”, jak iw żelu.
Reakcja lizy (RL)
Surowisko odpornościowe, które dostaje się do organizmu pacjenta, oprócz swojej głównej funkcji odporności biernej, ma również właściwości lizujące. Jest w stanie rozpuszczać czynniki drobnoustrojowe, obce elementy komórkowe i wirusy, które dostają się do organizmu pacjenta. W zależności od swoistości przeciwciał zawartych w surowicy izoluje się bakteriolizyny, cytolizyny, spirochetolizyny, hemolizyny i inne.
Te specyficzne przeciwciała nazywane są „uzupełniaczem”. Znajduje się w prawie wszystkich płynach ustrojowych człowieka, ma złożoną strukturę białkową i jest niezwykle wrażliwy na wzrost temperatury, wstrząsy, kwasy i bezpośrednie działanie promieni słonecznych. Ale w stanie wysuszonym jest w stanie zachowaćjego właściwości lizujące do sześciu miesięcy.
Istnieją tego typu reakcje serologiczne:
- bakterioliza;
- hemoliza.
Bakteriolizę przeprowadza się przy użyciu surowicy krwi pacjenta i swoistej surowicy odpornościowej z żywymi drobnoustrojami. Jeśli we krwi znajduje się wystarczająca ilość dopełniacza, badacz zobaczy, że bakterie ulegają lizie, a reakcja zostanie uznana za pozytywną.
Druga reakcja serologiczna krwi polega na tym, że zawiesinę czerwonych krwinek pacjenta traktuje się surowicą zawierającą hemolizyny, które są aktywowane tylko w obecności określonego komplementu. Jeśli takowy jest, asystent laboratoryjny obserwuje rozpuszczanie czerwonych krwinek. Ta reakcja jest szeroko stosowana we współczesnej medycynie do oznaczania miana dopełniacza (to znaczy jego najmniejszej ilości, która wywołuje lizę erytrocytów) w surowicy krwi oraz do wykonywania analizy wiązania dopełniacza. W ten sposób przeprowadza się test serologiczny na kiłę – reakcja Wassermana.
Reakcja wiązania dopełniacza (CFR)
Ta reakcja służy do wykrywania przeciwciał przeciwko czynnikowi zakaźnemu w surowicy krwi pacjenta, a także do identyfikacji patogenu na podstawie jego struktury antygenowej.
Do tego momentu opisaliśmy proste reakcje serologiczne. RSK jest uważany za reakcję złożoną, ponieważ oddziałują w niej nie dwa, ale trzy elementy: przeciwciało, antygen i dopełniacz. Jego istota polega na tym, że interakcja między przeciwciałem a antygenemwystępuje tylko w obecności białek dopełniacza, które są adsorbowane na powierzchni powstałego kompleksu AG-AT.
Sam antygeny po dodaniu dopełniacza ulegają znacznym zmianom, które świadczą o jakości reakcji. Może to być liza, hemoliza, unieruchomienie, działanie bakteriobójcze lub bakteriostatyczne.
Sama reakcja przebiega w dwóch fazach:
- Tworzenie kompleksu antygen-przeciwciało, który nie jest wizualnie widoczny dla badającego.
- Zmiana antygenu pod wpływem działania dopełniacza. Ten etap najczęściej można prześledzić gołym okiem. Jeśli reakcja nie jest widoczna wizualnie, do identyfikacji zmian wykorzystywany jest dodatkowy system wskaźników.
System wskaźników
Ta reakcja opiera się na wiązaniu dopełniacza. Oczyszczone erytrocyty barana i surowicę hemolityczną bez dopełniacza dodaje się do probówki godzinę po ustawieniu RSC. Jeśli niezwiązany dopełniacz pozostanie w probówce, połączy się z kompleksem AG-AT utworzonym między krwinkami owcy a hemolizyną i spowoduje ich rozpuszczenie. Oznacza to, że RSK jest ujemny. Jeśli erytrocyty pozostały nienaruszone, to odpowiednio reakcja jest pozytywna.
Test hemaglutynacji (RGA)
Istnieją dwie zasadniczo różne reakcje hemaglutynacji. Jedna z nich jest serologiczna, służy do oznaczania grup krwi. W tym przypadku czerwone krwinki wchodzą w interakcję z przeciwciałami.
I drugireakcja nie dotyczy serologicznych, ponieważ czerwone krwinki reagują z hemaglutyninami wytwarzanymi przez wirusy. Ponieważ każdy patogen działa tylko na określone erytrocyty (kurczak, jagnięcina, małpa), tę reakcję można uznać za wysoce specyficzną.
Możesz stwierdzić, czy reakcja jest dodatnia, czy ujemna, po lokalizacji komórek krwi na dnie probówki. Jeśli ich wzór przypomina odwrócony parasol, oznacza to, że pożądany wirus jest obecny we krwi pacjenta. A jeśli wszystkie erytrocyty uformowały się jak kolumna monet, to nie ma pożądanych patogenów.
Test hamowania hemaglutynacji (HITA)
Jest to wysoce specyficzna reakcja, która pozwala określić typ, typ wirusów lub obecność specyficznych przeciwciał w surowicy krwi pacjenta.
Jego istota polega na tym, że przeciwciała dodane do probówki z materiałem testowym zapobiegają odkładaniu się antygenów na erytrocytach, tym samym hamując hemaglutynację. Jest to jakościowy znak obecności we krwi specyficznych antygenów konkretnego poszukiwanego wirusa.
Reakcja immunofluorescencyjna (RIF)
Reakcja opiera się na zdolności wykrywania kompleksów AG-AT za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po ich potraktowaniu barwnikami fluorochromowymi. Ta metoda jest łatwa w obsłudze, nie wymaga izolacji czystej kultury i zajmuje niewiele czasu. Jest niezbędny do szybkiej diagnozy chorób zakaźnych.
W praktyce te reakcje serologiczne dzielą się na dwa typy: bezpośrednie i pośrednie.
Bezpośredni RIF jest produkowany zantygen, który jest wstępnie traktowany surowicą fluorescencyjną. Pośrednia polega na tym, że najpierw lek jest leczony konwencjonalną diagnostyką zawierającą antygeny dla interesujących przeciwciał, a następnie luminescencyjna surowica, która jest specyficzna dla białek kompleksu AG-AT, jest ponownie aplikowana i komórki drobnoustrojów stają się widoczne pod mikroskopem.
