W celu ustalenia jakościowego składu wielu produktów spożywczych wykorzystuje się reakcję ksantoproteinową na białko. Obecność aminokwasów aromatycznych w związku da pozytywną zmianę koloru badanej próbki.
Co to jest białko
Nazywane jest również białkiem, które jest budulcem żywego organizmu. Białka utrzymują objętość mięśni, odbudowują uszkodzone i martwe struktury tkankowe różnych narządów, czy to włosów, skóry czy więzadeł. Przy ich udziale powstają czerwone krwinki, regulowane jest normalne funkcjonowanie wielu hormonów i komórek układu odpornościowego.
Jest to złożona cząsteczka, która jest polipeptydem o masie większej niż 6103 d altonów. Strukturę białka tworzą reszty aminokwasowe w dużych ilościach, połączone wiązaniem peptydowym.
Struktura białka
Wyróżniającą cechą tych substancji w porównaniu z peptydami o niskiej masie cząsteczkowej jest ich rozwinięta przestrzenna struktura trójwymiarowa, poparta wpływami różnychstopień przyciągania. Białka mają czteropoziomową strukturę. Każdy z nich ma swoją własną charakterystykę.
Podstawowa organizacja ich cząsteczek opiera się na sekwencji aminokwasów, której struktura jest rozpoznawana przez reakcję ksantoproteiny na białko. Taka struktura jest okresowo powtarzającym się wiązaniem peptydowym -HN-CH-CO-, a rodniki łańcucha bocznego w kwasach aminokarboksylowych są częścią selektywną. To oni określają w przyszłości właściwości substancji jako całości.
Pierwsza struktura białka jest uważana za wystarczająco silną, wynika to z obecności silnych oddziaływań kowalencyjnych w wiązaniach peptydowych. Powstawanie kolejnych poziomów następuje w zależności od znaków ustalonych na początkowym etapie.
Utworzenie struktury drugorzędowej jest możliwe dzięki skręceniu sekwencji aminokwasów w spiralę, w której między zwojami powstają wiązania wodorowe.
Trzeciorzędowy poziom organizacji cząsteczki powstaje, gdy jedna część helisy jest nakładana na inne fragmenty, z pojawieniem się między nimi wszelkiego rodzaju wiązań z wodorem, dwusiarczkiem, związkiem kowalencyjnym lub jonowym. Rezultatem są skojarzenia w postaci kulek.
Przestrzenne rozmieszczenie struktur trzeciorzędowych z tworzeniem wiązań chemicznych między nimi prowadzi do powstania ostatecznej postaci cząsteczki lub poziomu czwartorzędowego.
Aminokwasy
Określają właściwości chemiczne białek. Istnieje około 20 głównych aminokwasów,zawarte w składzie polipeptydów w różnych sekwencjach. Obejmuje to również rzadkie kwasy aminokarboksylowe w postaci hydroksyproliny i hydroksylizyny, które są pochodnymi zasadowych peptydów.
Jako oznaka reakcji ksantoproteinowej rozpoznawania białek, obecność poszczególnych aminokwasów powoduje zmianę koloru odczynników, co sugeruje obecność określonych struktur w ich składzie.
Jak się okazało, wszystkie są kwasami karboksylowymi, w których atom wodoru został zastąpiony grupą aminową.
Przykładem budowy cząsteczki jest wzór strukturalny glicyny (HNH−HCH−COOH) jako najprostszego aminokwasu.
W tym przypadku jeden z wodorów CH2- można zastąpić dłuższym rodnikiem, w tym pierścieniem benzenowym, grupami aminowymi, sulfonowymi i karboksylowymi.
Co oznacza reakcja ksantoproteinowa
Do jakościowej analizy białek stosowane są różne metody. Należą do nich reakcje:
- biuret z fioletowym zabarwieniem;
- ninhydryna do utworzenia niebiesko-fioletowego roztworu;
- formaldehyd z czerwonym zabarwieniem;
- Folia z szaro-czarną sedymentacją.
Podczas wykonywania każdej metody udowodniono obecność białek i obecność określonej grupy funkcyjnej w ich cząsteczce.
Zachodzi reakcja ksantoproteinowa na białko. Nazywa się to również testem Muldera. Odnosi się do reakcji barwnych na białkach, wktóre są aminokwasami aromatycznymi i heterocyklicznymi.
Cechą takiego testu jest proces nitrowania cyklicznych reszt aminokwasowych kwasem azotowym, w szczególności dodanie grupy nitrowej do pierścienia benzenowego.
W wyniku tego procesu powstaje związek nitro, który wytrąca się. To główna oznaka reakcji ksantoproteinowej.
Jakie aminokwasy są określane
Nie wszystkie kwasy aminokarboksylowe można wykryć za pomocą tego testu. Główną cechą ksantoproteinowej reakcji rozpoznawania białek jest obecność pierścienia benzenowego lub heterocyklu w cząsteczce aminokwasu.
Z białkowych kwasów aminokarboksylowych wyodrębniono dwa kwasy aromatyczne, w których występuje grupa fenylowa (w fenyloalaniny) i rodnik hydroksyfenylowy (w tyrozynie).
Reakcja ksantoproteinowa służy do określenia heterocyklicznego aminokwasu tryptofanu, który ma aromatyczne jądro indolu. Obecność powyższych związków w białku daje charakterystyczną zmianę barwy pożywki testowej.
Jakie odczynniki są używane
Aby przeprowadzić reakcję ksantoproteinową, będziesz musiał przygotować 1% roztwór białka jajecznego lub roślinnego.
Zazwyczaj używaj jaja kurzego, które jest łamane w celu dalszego oddzielenia białka od żółtka. Aby uzyskać roztwór, 1% białka rozcieńcza się w dziesięciokrotnej ilości oczyszczonej wody. Po rozpuszczeniu białka uzyskaną ciecz należy przefiltrować przez kilka warstw gazy. To rozwiązanie powinno być przechowywane w chłodnym miejscu.
Możesz przeprowadzić reakcję z białkiem roślinnym. Do przygotowania roztworu używa się mąki pszennej w ilości 0,04 kg. Dodaj 0,16 l oczyszczonej wody. Składniki miesza się w kolbie, którą umieszcza się na 24 godziny w chłodnym miejscu o temperaturze około + 1°C. Po dniu roztwór jest wstrząsany, po czym jest filtrowany najpierw za pomocą waty, a następnie przez papierowy filtr harmonijkowy. Powstały płyn jest przechowywany w zimnym miejscu. W takim rozwiązaniu występuje głównie frakcja albumin.
Do przeprowadzenia reakcji ksantoproteinowej jako główny odczynnik stosuje się stężony kwas azotowy. Dodatkowe odczynniki to 10% roztwór wodorotlenku sodu lub amoniaku, roztwór żelatyny i niestężony fenol.
Metodologia
Do czystej probówki dodaj 1% roztwór białka jaja lub mąki w ilości 2 ml. Dodaje się do niego około 9 kropli stężonego kwasu azotowego, aby zapobiec wypadaniu płatków. Powstała mieszanina jest podgrzewana, w wyniku czego osad żółknie i stopniowo zanika, a jego kolor przechodzi w roztwór.
Gdy ciecz ostygnie, do probówki wzdłuż ścianki dodaje się około 9 kropli stężonego wodorotlenku sodu, co jest nadmiarem dla procesu. Odczyn medium staje się zasadowy. Zawartość tuby zmieni kolor na pomarańczowy.
Funkcje
Ponieważ ksantoproteina nazywana jest jakościową reakcją na białka podprzez działanie kwasu azotowego, test przeprowadza się pod dołączonym wyciągiem. Podczas pracy ze stężonymi substancjami żrącymi przestrzegaj wszystkich środków bezpieczeństwa.
Podczas nagrzewania może dojść do wyrzucenia zawartości tuby, co należy wziąć pod uwagę przy mocowaniu jej w uchwycie i doborze nachylenia.
Przyjmowanie stężonego kwasu azotowego i wodorotlenku sodu powinno odbywać się wyłącznie szklaną pipetą i gumową gruszką, zabrania się pisania ustami.
Reakcja porównawcza z fenolem
Aby zilustrować proces i potwierdzić obecność grupy fenylowej, podobny test przeprowadza się z hydroksybenzenem.
Wprowadź 2 ml rozcieńczonego fenolu do probówki, a następnie stopniowo, wzdłuż ścianki dodaj 2 ml stężonego kwasu azotowego. Roztwór poddaje się ogrzewaniu, w wyniku czego żółknie. Ta reakcja jest jakościowa dla obecności pierścienia benzenowego.
Procesowi nitrowania hydroksybenzenu kwasem azotowym towarzyszy tworzenie się mieszaniny paranitrofenolu i ortonitrofenolu w stosunku procentowym od 15 do 35.
Porównanie żelatyny
Aby udowodnić, że reakcja ksantoproteiny na białko wykrywa tylko aminokwasy o strukturze aromatycznej, stosuje się białka, które nie mają grupy fenolowej.
Do czystej probówki wprowadzić 1% roztwór żelatyny w ilości 2 ml. Dodaje się do niego około 9 kropli stężonego kwasu azotowego. Otrzymaną mieszaninę ogrzewa się. Roztwór nie żółknie, co świadczy o brakuaminokwasy o aromatycznej strukturze. Czasami obserwuje się lekkie zażółcenie podłoża z powodu obecności zanieczyszczeń białkowych.
Równania chemiczne
Reakcja ksantoproteiny na białka przebiega w dwóch etapach. Wzór pierwszego etapu opisuje proces nitrowania cząsteczki aminokwasu za pomocą stężonego kwasu azotowego.
Przykładem jest dodanie grupy nitrowej do tyrozyny w celu utworzenia nitrotyrozyny i dinitrotyrozyny. W pierwszym przypadku jeden rodnik NO2 jest przyłączony do pierścienia benzenowego, aw drugim przypadku dwa atomy wodoru są zastąpione przez NO2. Wzór chemiczny reakcji ksantoproteinowej jest reprezentowany przez oddziaływanie tyrozyny z kwasem azotowym w celu utworzenia cząsteczki nitrotyrozyny.
Procesowi nitrowania towarzyszy przejście bezbarwnego koloru w żółty odcień. Podczas przeprowadzania podobnej reakcji z białkami zawierającymi reszty aminokwasowe tryptofanu lub fenyloalaniny zmienia się również kolor roztworu.
Na drugim etapie produkty nitrowania cząsteczki tyrozyny, w szczególności nitrotyrozyny, oddziałują z wodorotlenkiem amonu lub sodu. Rezultatem jest sól sodowa lub amonowa, która ma kolor żółto-pomarańczowy. Ta reakcja jest związana ze zdolnością cząsteczki nitrotyrozyny do przechodzenia do postaci chinoidu. Później powstaje z niego sól kwasu nitronowego, która posiada chinonowy układ podwójnych wiązań sprzężonych.
Tak kończy się reakcja ksantoproteiny na białka. Równanie drugieetap jest przedstawiony powyżej.
Wyniki
Podczas analizy płynów zawartych w trzech probówkach jako roztwór odniesienia służy rozcieńczony fenol. Substancje z pierścieniem benzenowym dają jakościową reakcję z kwasem azotowym. W rezultacie zmienia się kolor roztworu.
Jak wiesz, żelatyna zawiera kolagen w postaci hydrolizowanej. Białko to nie zawiera aromatycznych kwasów aminokarboksylowych. Podczas interakcji z kwasem nie następuje zmiana koloru podłoża.
W trzeciej probówce obserwuje się pozytywną reakcję ksantoproteiny na białka. Wniosek można wyciągnąć w następujący sposób: wszystkie białka o strukturze aromatycznej, czy to grupa fenylowa, czy pierścień indolowy, zmieniają kolor roztworu. Wynika to z tworzenia żółtych związków nitrowych.
Przeprowadzenie reakcji barwnej świadczy o obecności różnych struktur chemicznych w aminokwasach i białkach. Przykład żelatyny pokazuje, że zawiera ona kwasy aminokarboksylowe, które nie mają grupy fenylowej ani struktury cyklicznej.
Reakcja ksantoproteinowa może wyjaśniać żółknięcie skóry po nałożeniu na nią silnego kwasu azotowego. Pianka mleczna nabierze tego samego koloru po przeprowadzeniu z nią takiej analizy.
W praktyce laboratorium medycznego ta próbka koloru nie jest używana do wykrywania białka w moczu. Wynika to z żółtego koloru samego moczu.
Reakcja ksantoproteinowa jest coraz częściej stosowana do ilościowego oznaczania aminokwasów, takich jak tryptofan i tyrozyna w różnych białkach.
