PCR lub reakcja łańcuchowa polimerazy to zaawansowana technika laboratoryjna, która jest szeroko stosowana w medycynie i innych dziedzinach naukowych. Diagnostyka PCR w pewnym momencie stała się prawdziwym przełomem w nauce.
Opis
Ilościowy PCR to rodzaj PCR w czasie rzeczywistym.
Jest to rozumiane jako wariant PCR, w którym kinetyka reakcji jest stale rejestrowana, co umożliwia jakościową ocenę zawartości określonych sekwencji nukleotydowych DNA w złożonej mieszaninie molekularnej.
Metoda ilościowego PCR zostanie omówiona bardziej szczegółowo poniżej.
Istota analizy
Metody kulturowe i serologiczne są szczególnie często wykorzystywane do diagnozowania infekcji. W ramach pierwszego określa się przeciwciała przeciwko zakaźnemu patogenowi w surowicy krwi. W drugim, materiał biologiczny pobrany od chorego służy do wysiewu specyficznej pożywki sprzyjającej wzrostowi kolonii patogenów. Diagnostyka w obusprawa może trwać dni lub tygodnie.
Badanie PCR można przeprowadzić przy użyciu różnych materiałów biologicznych, które pozyskuje się od chorej osoby. Krew i inne patologiczne, fizjologiczne i biologiczne media i płyny działają jako próbki. Możesz zrobić PCR kał lub mocz.
Zakażenia atypowe i wirusowe są najczęściej diagnozowane metodą ilościowej PCR, ponieważ mogą nie być łatwe do zdiagnozowania ze względu na specyficzny charakter wywołanego przez nie procesu patologicznego. Aby określić takie infekcje, potrzeba czasu, podczas którego w organizmie zaczynają wytwarzać się przeciwciała, określone metodami serologicznymi. Ale w niektórych przypadkach jest to nie do przyjęcia.
Sposób przeprowadzania
Metoda PCR - laboratoryjne wykrywanie infekcji w próbkach izolowanych od pacjenta (in vitro).
Do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy wymagany jest zestaw specjalnych odczynników.
Materiał testowy jest wprowadzany do probówek z odczynnikami. Probówki umieszcza się w specjalnej aparaturze – wzmacniaczu PCR, który ma za zadanie amplifikować (zwiększać liczbę) żądanych fragmentów RNA lub DNA, wzmacniacz PCR pracuje w trybie cyklicznym. W każdym cyklu, jeśli próbki zawierają sekwencję RNA lub DNA patogenu, w roztworze gromadzi się coraz więcej kopii cząstek tych kwasów nukleinowych. Możesz określić obecność patogenu i jego ilość w próbkach.
Rodzaje PCR
Analiza jakościowa metodą PCR pozwala uzyskać następujący wynik:
- ujemne, gdy w próbkach nie znaleziono patogenu będącego przedmiotem zainteresowania;
- pozytywny, jeśli w próbkach znaleziono sekwencje charakterystyczne dla określonego patogenu.
Z pozytywnym wynikiem PCR możemy mówić z 95% dokładnością o obecności zdiagnozowanej infekcji. Jednocześnie dokładność zestawów PCR wykorzystywanych do celów diagnostycznych sięga 100%.
Zazwyczaj 5% błędnych wyników jest określanych przez czynnik ludzki. Na przykład naruszenie techniki analizy i przechowywania odczynników może znacznie zmniejszyć dokładność badania.
Ilościowa reakcja PCR definiuje pojęcie obciążenia wirusem. Możliwe jest określenie, ile zestawów DNA patogenów znajdowało się w próbkach pobranych od pacjenta.
Powaga infekcji jest wprost proporcjonalna do wzrostu ich liczby. Możesz również określić powodzenie terapii w celu zmniejszenia miana wirusa.
Zgłoszenie biomateriału PCR
Ilościowy PCR jest przeprowadzany w klinice, głównie rano. Podczas wizyty u lekarza pacjent zostanie poinformowany, co należy zrobić: skrobanie, rozmazy, mocz czy krew. PCR może wykryć patogeny niezależnie od poziomu zanieczyszczenia materiału.
Do pozytywnej analizy teoretycznie wymagana jest obecność tylko jednego patogenu w próbkach. W praktyce starają się stworzyć jeszcze korzystniejsze warunki. Oto kilka zaleceń:
- jeśli pobiorą skrobanie lub wymaz z genitaliównarządów, musisz powstrzymać się od stosunku intymnego na trzy dni przed badaniem;
- nie można obmywać lekami przeciwbakteryjnymi ani umyć się przed analizą;
- trzy godziny przed pobraniem wymazu z cewki moczowej musisz uzbroić się w cierpliwość i nie opróżniać jelit.
Nie przestrzegaj tych zasad podczas oddawania krwi.
Jak interpretowane są wyniki ilościowej analizy PCR?
Ilościowa ocena uzyskanych wyników
W wielu sytuacjach klinicznych pojawia się problem skuteczności leczenia i/lub dynamiki procesu patologicznego. Takie pytania są szczególnie istotne podczas badania osób z przewlekłymi infekcjami (ludzki wirus niedoboru odporności, wirusowe zapalenie wątroby typu B i C). W diagnostyce opierają się na fakcie, że akumulacja amplikonów (produktów PCR) jest proporcjonalna do obecności kopii pożądanego genu w analizowanej próbce.
Oczywiście, biorąc pod uwagę wyniki ilościowego PCR, przeprowadza się elektroforezę żelową z badaniem intensywności specjalnych sygnałów PCR. Warunkiem prawidłowej oceny ilościowej otrzymanych wyników są również pozytywne, wiarygodne próbki kontrolne zawierające znaną liczbę kopii pożądanego genu (np. tysiąc kopii genu zapalenia wątroby typu C na jedną reakcję PCR). Kilka seryjnych rozcieńczeń kontroli ilościowej umożliwia wygenerowanie krzywych kalibracyjnych i jest używanych do oceny zawartości genokopii klinicznych w próbkach klinicznych.
W definicji ilościowego PCR kluczowym osiągnięciem było stworzeniefluorescencyjne sondy DNA, które są dodawane do mieszaniny reakcyjnej jednocześnie z prostymi starterami i umożliwiają śledzenie procesu PCR w czasie, czyli PCR w czasie rzeczywistym.
Metodologia TaqMan odnosi się do syntezy fluorescencyjnych sond DNA, które są specyficzne dla środkowej części amplikonu i mają dwa znaczniki na końcach. Jeden z nich to znacznik fluorescencyjny, drugi to cząsteczka wygaszacza dla tej fluorescencji.
Specjalne urządzenie, które jest hybrydą fluorymetru i termobloku-wzmacniacza, dokonuje ciągłych pomiarów fluorescencji w każdej probówce (zasada real-time PCR). Po 20-40 cyklach PCR dla każdej próbki zostaną uzyskane indywidualne krzywe. Liczbę kopii pożądanego genu, która jest zawarta w próbce testowej, można obliczyć z krzywych kalibracyjnych z próbkami kontrolnymi.
Ponadto ważną cechą implementacji PCR metodą fluorescencyjną jest to, że biorąc pod uwagę wyniki, nie ma potrzeby otwierania probówek z mieszaniną PCR. Zmniejsza to możliwość zanieczyszczenia pomieszczenia produktami do amplifikacji i nie ma potrzeby przydzielania specjalnych obszarów roboczych do elektroforezy.
Co pokazuje ilościowy transkrypt PCR?
Co jest odkrywane?
Dzięki metodzie, takiej jak ilościowa PCR, można wykryć jakościowe zmiany w genach: insercje, delecje i mutacje punktowe. Ale w przypadku niektórych zaburzeń dziedzicznych odpowiednie objawy pojawiają się w odpowiedzi na zmianę zawartości niektórych genów.
DziękiAnaliza ilościowa daje wynik liczbowy, najczęściej w IU/ml. Oznacza to, że w jednym mililitrze badanej próbki znaleziono określoną liczbę kopii RNA lub DNA patogenu, mierzoną w jednostkach międzynarodowych.
W zależności od wielkości diagnozowana jest powaga infekcji. Krew jest zwykle testowana w celu określenia miana wirusa, ponieważ wirusy poruszają się swobodnie we krwi podczas choroby.
Funkcje
Ilościowy PCR w badaniu krwi ma dwie cechy.
- Analiza jest przeprowadzana w obecności starterów lub trifosforanów dezoksyrybonukleozydów, które są znakowane znacznikiem fluorescencyjnym lub radioaktywnym w celu dokładnego określenia zawartości utworzonego produktu PCR.
- W procesie PCR, zakończ reakcję wcześniej, zanim pojawi się zbyt wiele produktów PCR. Wynika to z faktu, że na końcowym etapie saturacji, kiedy produktów PCR jest dużo, zarówno sam enzym, jak i substraty pełnią rolę ogniw ograniczających tę reakcję. Koniec kolejnego cyklu PCR w takich warunkach nie charakteryzuje się już podwojeniem liczby produktów PCR, niwelowane są nieznaczne różnice ilościowe między różnymi próbkami, które są dość wyraźnie określone we wczesnych etapach po przejściu przez szereg cykli reakcyjnych.
Koszt diagnostyki PCR
Badania PCR wiążą się z kosztami, które zależą od rodzaju testowanej infekcji, metodologii analizy i materiału testowego. Aby określić jedną infekcję, będziesz musiał dać w ciągu200-800 rubli. Doliczana jest również opłata za pobranie biomateriału - około 400 rubli.
