Rekombinowane DNA to cząsteczki utworzone przez laboratoryjne techniki rekombinacji genetycznej w celu połączenia materiału genetycznego z wielu źródeł. Jest to możliwe, ponieważ cząsteczki DNA wszystkich organizmów mają tę samą strukturę chemiczną i różnią się jedynie sekwencją nukleotydów w jej obrębie.
Tworzenie
Klonowanie molekularne to proces laboratoryjny używany do tworzenia zrekombinowanego DNA. Jest to jedna z dwóch najczęściej stosowanych metod, obok reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Pozwala kontrolować replikację dowolnej konkretnej sekwencji DNA wybranej przez eksperymentatora.
Istnieją dwie zasadnicze różnice między metodami rekombinacji DNA. Jednym z nich jest to, że klonowanie molekularne obejmuje replikację w żywej komórce, podczas gdy PCR obejmuje in vitro. Kolejną różnicą jest to, że pierwsza metoda umożliwia wycinanie i wklejanie sekwencji DNA, podczas gdy druga jest wzbogacana przez kopiowanie istniejącej kolejności.
Wektorowe DNA
Pozyskiwanie rekombinowanego DNA wymaga wektora do klonowania. Pochodzi z plazmidów lub wirusów i jest stosunkowo małym segmentem. Wybór wektora do klonowania molekularnego zależy od wyboru organizmu gospodarza, wielkości sklonowanego DNA i tego, czy zachodzi ekspresja obcych cząsteczek. Segmenty można łączyć przy użyciu różnych metod, takich jak klonowanie enzymów restrykcyjnych/ligazy lub łączenie Gibsona.
Klonowanie
W standardowych protokołach klonowanie obejmuje siedem kroków.
- Wybierz organizm gospodarza i wektor do klonowania.
- Uzyskiwanie wektora DNA.
- Tworzenie sklonowanego DNA.
- Tworzenie rekombinowanego DNA.
- Wprowadzanie go do organizmu gospodarza.
- Wybór organizmów go zawierających.
- Wybór klonów z pożądanymi wstawkami DNA i właściwościami biologicznymi.
Po transplantacji do organizmu gospodarza obce cząsteczki zawarte w rekombinowanym konstrukcie mogą ulegać ekspresji lub nie. Ekspresja wymaga restrukturyzacji genu, aby zawierał sekwencje niezbędne do produkcji DNA. Jest używany przez maszynę tłumaczącą hosta.
Jak to działa
Rekombinowany DNA działa, gdy komórka gospodarza wyraża białko z rekombinowanych genów. Ekspresja zależy od otoczenia genu zestawem sygnałów, które dostarczają instrukcji do jego transkrypcji. Obejmują one promotor, wiązanie rybosomów i terminator.
Problemy powstają, jeśli genzawiera introny lub sygnały, które działają jako terminatory dla gospodarza bakteryjnego. Prowadzi to do przedwczesnego zakończenia. Rekombinowane białko może być niewłaściwie przetworzone, zwinięte lub zdegradowane. Jego produkcja w układach eukariotycznych zwykle zachodzi w drożdżach i grzybach strzępkowych. Korzystanie z klatek dla zwierząt jest trudne ze względu na potrzebę posiadania mocnej powierzchni nośnej dla wielu osób.
Właściwości organizmów
Organizmy zawierające rekombinowane cząsteczki DNA mają najwyraźniej normalne fenotypy. Ich wygląd, zachowanie i metabolizm zwykle się nie zmieniają. Jedynym sposobem wykazania obecności zrekombinowanych sekwencji jest zbadanie samego DNA za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy.
W niektórych przypadkach rekombinowany DNA może mieć szkodliwe skutki. Może się tak zdarzyć, gdy jego fragment zawierający aktywny promotor znajduje się obok genu komórki gospodarza, który wcześniej milczał.
Użyj
Technologia rekombinacji DNA jest szeroko stosowana w biotechnologii, medycynie i badaniach. Jej białka i inne produkty można znaleźć niemal w każdej zachodniej aptece, przychodni weterynaryjnej, gabinecie lekarskim, laboratorium medycznym czy biologicznym.
Najczęstsze zastosowanie to badania podstawowe, w których technologia jest niezbędna w wielu dzisiejszych pracach w naukach biologicznych i biomedycznych. Rekombinowany DNA służy do identyfikacji, mapowania i sekwencjonowania genów oraz ich określaniaFunkcje. Sondy rDNA służą do analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach oraz w tkankach całych organizmów. Białka rekombinowane są używane jako odczynniki w eksperymentach laboratoryjnych. Kilka konkretnych przykładów podano poniżej.
Rekombinowana chymozyna
Znaleziona w trawieńcu chymozyna jest enzymem potrzebnym do produkcji sera. Był to pierwszy genetycznie modyfikowany dodatek do żywności stosowany w branży. Mikrobiologicznie wytworzony rekombinowany enzym strukturalnie identyczny z enzymem pochodzącym z cielęcia jest tańszy i wytwarzany w większych ilościach.
Rekombinowana ludzka insulina
Praktycznie zastąpiono insulinę pochodzącą ze źródeł zwierzęcych (np. świń i bydła) w leczeniu cukrzycy insulinozależnej. Rekombinowana insulina jest syntetyzowana przez wprowadzenie genu ludzkiej insuliny do bakterii z rodzaju Eterichia lub drożdży.
Hormon wzrostu
Przeznaczony dla pacjentów, których przysadka nie wytwarza wystarczającej ilości hormonu wzrostu, aby wspomóc normalny rozwój. Zanim stał się dostępny rekombinowany hormon wzrostu, pozyskiwano go z przysadki mózgowej zwłok. Ta niebezpieczna praktyka doprowadziła u niektórych pacjentów do rozwoju choroby Creutzfeldta-Jakoba.
Rekombinowany czynnik krzepnięcia
Jest to białko powodujące krzepnięcie krwi, które jest podawane pacjentom z postaciami hemofilii z zaburzeniami krzepnięcia. Nie są w stanie wyprodukowaćczynnik VIII w wystarczających ilościach. Przed opracowaniem rekombinowanego czynnika VIII, białko wytwarzano przez przetwarzanie dużych ilości ludzkiej krwi od wielu dawców. Wiązało się to z bardzo wysokim ryzykiem przenoszenia chorób zakaźnych.
Diagnoza zakażenia wirusem HIV
Każda z trzech powszechnie stosowanych metod diagnozowania zakażenia wirusem HIV została opracowana przy użyciu rekombinowanego DNA. Test na przeciwciała wykorzystuje jej białko. Wykrywa obecność materiału genetycznego wirusa HIV za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Opracowanie testu było możliwe dzięki klonowaniu molekularnemu i sekwencjonowaniu genomów HIV.
